Nel 1525 venne stipulato a Cracovia un trattato tra il Re Sigismondo di Polonia e suo nipote, il Gran Maestro dell’Ordine Teutinico Alberto di Brandeburgo-Ansbach, che prevedeva la secolarizzazione dello Stato Monastico dell’Ordine Teutonico e la sua effettiva transizione al luteranesimo.
Alberto avrebbe ricevuto per se e per i suoi eredi il titolo secolare di Duca di Prussia, ma doveva riconoscere la Prussia come un feudo vassallo della corona polacca ed impegnarsi a fornire assistenza militare alla Polonia. Dopo questo accordo, venne investito del ducato il 10 febbraio 1525.
Gli Stati Generali della regione vennero convocati a Königsberg e resero omaggio al nuovo duca, che usò i suoi pieni poteri per diffondere la dottrina di Lutero.
Alberto aderì alla Lega di Torgau nel 1526 e fu tra i principi che
tentarono di rovesciare Carlo V dopo che era stato emanato il Bando contro tutti
i principi tedeschi non cattolici.
I primi anni di governo di Alberto sulla Prussia si possono associare principalmente ai cambiamenti religiosi e culturali che consolidarono lo status del Ducato come centro culturale regionale. Egli incrementò l'istruzione stabilendo una scuola in ogni villaggio. Nel 1540 a Konigsberg rese pubblica la biblioteca che composta dalla collezione di libri del Castello del duca. Nel 1544, sempre a Königsberg istituì l’Università (il Collegium Albertinum), una delle più antiche università dell’Europa orientale.
Ma il peso delle tasse diveniva sempre maggiore e Alberto divenne sempre più impopolare; si arrivò alla necessità di nominare un reggente che sopperisse alle incapacità di Alberto e venne scelto Alberto Federico.
Anche se Alberto Federico fu Duca di Prussia dal 1568 fino alla sua morte, dava segni di disturbo mentale ed il ducato dal 1603 venne retto dal genero Gioacchino di Brandeburgo, in quanto Alberto era incapace di intendere e di volere. Alla morte di Gioacchino, nel 1608, il ducato venne retto da Giovanni Sigismondo, il quale alla morte di Alberto divenne il nuovo duca. Alberto Federico fu il secondo ed ultimo Duca di Prussia appartenente al ramo Ansbach della famiglia Hohenzollern.
Dalla morte del fondatore del Ducato di Prussia, i suoi diretti discendenti governarono lo Stato per pochi anni. Alla morte Alberto Federico, avvenuta nel 1618, dopo la soppressione della linea maschile della successione, Re di Polonia trasmise il potere del Ducato di Prussia a Giovanni Sigismondo, Principe Elettore del Brandeburgo, che unì i due territori sotto un’unica dinastia formando il Brandeburgo-Prussia con capitale Berlino.
L'azione più significativa di Giovanni Sigismondo fu la sua conversione dal luteranesimo al calvinismo. Egli impose la conversione di massa della popolazione alla nuova fede calvinista, ma vi furono gravi proteste, con la moglie a capo dei luterani. La resistenza fu così forte che Giovanni Sigismondo rinunciò a qualsiasi tentativo di conversione forzata, consentendo ai suoi sudditi di essere luterani o calvinisti secondo i dettami della loro coscienza. D'ora innanzi, il Brandeburgo-Prussia sarebbe stato uno Stato biconfessionale.
Nel 1619 Giorgio Guglielmo di Brandeburgo, della dinastia degli Hohenzollern, ereditò il Margraviato di Brandeburgo ed il Ducato di Prussia. Durante la Guerra dei Trent'anni, inizialmente cercò di rimanere neutrale tra le forze cattoliche del Sacro Romano Impero ed i Principati protestanti.
Ma nonostante i suoi tentativi di neutralità, fu costretto di unirsi alle forze protestanti nel 1631. Sia le truppe protestanti che quelle cattoliche bruciarono e saccheggiarono il Brandeburgo e la popolazione fu decimata lì come negli altri Stati tedeschi durante quel conflitto.
Giorgio Guglielmo si ritirò dalla guerra e firmò la Pace di Praga con
l'imperatore Ferdinando II il 30 maggio 1635. Lasciando il suo Cancelliere, Adam
von Schwarzenberg, alla guida del Governo, Giorgio Guglielmo si ritirò nel 1637
nel Ducato di Prussia, regione relativamente al sicuro dalla guerra, dove visse
in ritiro fino alla sua morte nel 1640 a Königsberg. Gli succedette il figlio,
Federico Guglielmo.